培養(yǎng)活細(xì)胞可用相差顯微鏡直接觀察，也可用縮時(shí)攝影直接記錄活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化，還可將離體活細(xì)胞染色。
一、相差顯微鏡直接觀察法
活細(xì)胞對(duì)光線是透明的，光線通過(guò)活細(xì)胞時(shí)，波長(zhǎng)和振幅幾乎沒有改變，所以用普通光鏡無(wú)法看清未經(jīng)染色的活細(xì)胞。為了觀察活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，則需要通過(guò)其他途徑提高結(jié)構(gòu)的反差。本世紀(jì)30年代，荷蘭物理學(xué)家Zernike設(shè)計(jì)的相差顯微鏡(Phase contrast microscope)利用光的衍射和干涉特性，把透過(guò)標(biāo)本不同區(qū)域的光波的光程差轉(zhuǎn)變成振幅差，使細(xì)胞內(nèi)各種結(jié)構(gòu)之間呈現(xiàn)清晰可見的明暗對(duì)比，從而成功地解決了生物學(xué)上的大難題。
相差顯微鏡由相差聚光器和相差接物鏡兩個(gè)主要部分組成。它與普通光鏡相比多了兩個(gè)部件，一個(gè)是在聚光器上增加一個(gè)環(huán)形光闌，使透過(guò)聚光器的光線形成空心光錐、聚焦到標(biāo)本上。另一個(gè)是在物鏡的后焦面增加一個(gè)相板，相板有一個(gè)環(huán)形區(qū)，其大小恰好通過(guò)環(huán)形光闌束的直射光，相板各區(qū)鍍以不同物質(zhì)，使得通過(guò)環(huán)形區(qū)的光比通過(guò)相板其他部位的光超前或滯后1/4λ。
相差顯微鏡的基本原理是：把透過(guò)標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)之間的對(duì)比度，使標(biāo)本的各種結(jié)構(gòu)變得更清晰可見。光線透過(guò)標(biāo)本后，發(fā)生折射，偏離了未通過(guò)標(biāo)本的光線的光路，這兩組光線合軸后，則發(fā)生相互干涉現(xiàn)象。透過(guò)生物標(biāo)本發(fā)生折射的光線與未透過(guò)標(biāo)本的光線之間產(chǎn)生了光程差。前者被阻滯了1/4λ(波長(zhǎng))。如果把光程差再增加1/4λ，則變?yōu)?span lang="EN-US">1/2λ，合軸后兩束光線的干涉加強(qiáng)，使標(biāo)本周圍發(fā)生暈圈，提高了可見度。
用相差顯微鏡觀察活細(xì)胞，并可在鏡下連續(xù)拍攝記錄體外培養(yǎng)細(xì)胞的活動(dòng)，如細(xì)胞分裂、細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)等過(guò)程。相差顯微鏡觀察活細(xì)胞的步驟如下：
1、調(diào)整好相差顯微鏡
首先調(diào)好相位板，使聚光器相位板號(hào)與接物鏡放大倍數(shù)(相位板)相一致。然后抽出接目鏡，再換輔助望遠(yuǎn)鏡，移動(dòng)輔助鏡筒并調(diào)整聚光器相位板，使視影中兩個(gè)大小一樣的光環(huán)相互吻合。再重新?lián)Q上原接目鏡，即成相差圖像。當(dāng)更換不同倍數(shù)接物鏡時(shí)，需按上述過(guò)程重新調(diào)節(jié)。
2、觀察瓶皿準(zhǔn)備
準(zhǔn)備觀察的瓶、皿要平坦，質(zhì)地均勻，透光度好，在觀察前將培養(yǎng)瓶、皿面擦凈，勿留任何殘留污跡。
3、調(diào)光
主要調(diào)整照明光的照明度和光軸，令視野照明均勻。首先用低倍鏡，并把照明燈虹彩光調(diào)至最小，使光落于視野中央；如有偏斜可用聚光器的調(diào)整螺絲進(jìn)行調(diào)整。然后打開虹彩使視野內(nèi)呈均勻照明強(qiáng)度，并使目的物圖像達(dá)到最大限度反差為止。
4、調(diào)焦與攝影
較高級(jí)的相差顯微鏡視野中間都有雙線十字，調(diào)焦前先轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡使十字的雙線清晰，然后再用調(diào)焦旋扭調(diào)節(jié)物鏡，使觀察物體清晰。在照相目鏡上也要采用同樣步驟調(diào)焦。攝影目鏡與觀察目鏡焦點(diǎn)不一致時(shí)，也要根據(jù)需要調(diào)焦，一般照相時(shí)以攝影目鏡為主，觀察時(shí)以觀察目鏡為主。
照相時(shí)應(yīng)做好記錄，把細(xì)胞種類、代數(shù)、觀察內(nèi)容、放大倍數(shù)、時(shí)間等一一記錄下來(lái)，以備后查和對(duì)比。
5、細(xì)胞觀察
生長(zhǎng)在瓶底上的細(xì)胞最適宜用倒置光相差顯微鏡觀察，而且需附有長(zhǎng)焦距集光器，才能觀察厚度較大的培養(yǎng)瓶（或皿）。若用油浸鏡觀察細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)，需用支持物培養(yǎng)法，把細(xì)胞培養(yǎng)在長(zhǎng)形蓋片上，觀察時(shí)從瓶中取出制成臨時(shí)標(biāo)本。方法為：取一大型載物片，再取一塊優(yōu)質(zhì)濾紙剪成長(zhǎng)方窗形，置于載物片上，用吸管向紙框中滴數(shù)滴培養(yǎng)液，使充滿框內(nèi)空間和浸濕紙框；把生長(zhǎng)有細(xì)胞的蓋片含細(xì)胞面向上放在紙框中，再覆以大蓋片。觀察時(shí)應(yīng)不斷從標(biāo)本測(cè)面滴加適量營(yíng)養(yǎng)液，以防不斷蒸發(fā)。此法只限于短時(shí)間觀察細(xì)胞之用。
用相差顯微鏡觀察細(xì)胞應(yīng)注意瓶（或皿）的厚度、均勻性、清潔度、氣溫等。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)的培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶（或皿）一般成像效果都較好，但反復(fù)刷洗過(guò)的玻璃或塑料器皿將嚴(yán)重影響分辨力。天氣較冷時(shí)，若與顯微鏡觀察處溫差較大，由于溫差使培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)壁形成霧滴而影響觀察的清晰度，此時(shí)可輕輕將瓶?jī)A斜使瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液浸潤(rùn)內(nèi)壁，以得到好的相差像。若對(duì)原代細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行相差顯微照相，最好選擇換液后進(jìn)行，這樣可以去除漂浮的組織塊和死細(xì)胞，提高成像清晰度。觀察細(xì)胞時(shí)要有無(wú)菌概念，動(dòng)作要輕，避免猛烈振蕩。觀察時(shí)間不要太長(zhǎng)，觀察次數(shù)也不要太頻繁，以免影響細(xì)胞生長(zhǎng)。
二、暗視野顯微鏡技術(shù)觀察活細(xì)胞
暗視野顯微鏡(dark field microscope)是利用特殊的聚光器，使照明光線斜射不能進(jìn)入物鏡，所以視野是暗的，只有經(jīng)過(guò)標(biāo)本散射的光線才能進(jìn)入物鏡被放大，在黑暗的背景中呈現(xiàn)明亮的像。這種特殊的照明方式，使反差增大，分辨率提高，甚至可以觀察到5nm的微小質(zhì)點(diǎn)。這種觀察方法主要觀察物體的輪廓，分辨不清內(nèi)部的微細(xì)構(gòu)造，只適合于觀察活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體、液體介質(zhì)中的細(xì)菌和霉菌等。所以這種方法已較少應(yīng)用。
三、縮時(shí)顯微攝影觀察
這是隨著現(xiàn)代科技發(fā)展而出現(xiàn)的一種新的觀察方法?？s時(shí)顯微攝影術(shù)（time-Lapse Cinemicrophotagraphy,TLCM）可直接記錄活細(xì)胞的連續(xù)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，能非常直觀地展現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，如細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂、細(xì)胞膜變化、細(xì)胞死亡等過(guò)程。如接上顯微鏡閉路電視系統(tǒng)或接上觀察細(xì)胞變化的定格電視記錄裝置，則更直觀地觀察到細(xì)胞的變化。但由于這套系統(tǒng)較昂貴，所以應(yīng)用尚不普遍。
四、離體活細(xì)胞染色觀察
1、中性紅染色
中性紅是常用的活體染色染料，常用的濃度為1:10000，用生理鹽水(或Hanks液)溶解后進(jìn)行高壓蒸氣滅菌暗處存放，可直接浸染活體細(xì)胞顯微鏡下觀察或用于細(xì)胞的病毒蝕斑，肉眼計(jì)數(shù)空斑數(shù)目。因其毒性大，染色后細(xì)胞不能再培養(yǎng)。
2、結(jié)晶紫染色
使用濃度為0.1%，可用生理鹽水配制，室溫保存。該染料對(duì)死、活細(xì)胞均著色，故只能測(cè)出細(xì)胞總數(shù)。
3、臺(tái)盼藍(lán)染色
用0.5%濃度的臺(tái)盼藍(lán)（Trypan blue）,用PBS配制，室溫保存，該染料只對(duì)死細(xì)胞著色，可測(cè)定活細(xì)胞數(shù)和計(jì)算存活百分率。
